Introdução

As pipetas automáticas foram inventadas na década de 1940 por George Riggs. O invento pretendia ser uma alternativa às pipetas graduadas de vidro, utilizadas pelos inspetores de leite para recolher amostras visando avaliar a presença de bactérias. A pipeta automática facilitaria o trabalho e preveniria a contaminação dos inspetores, pois dispensava a sucção do líquido com a boca.

Atualmente as pipetas automáticas são amplamente utilizadas, principalmente em laboratórios de Biologia Molecular, Microbiologia e Bioquímica. Elas são capazes de transferir pequenos volumes (entre 0,25 µL – 5000 µL) com alta reprodutibilidade e exatidão. Cada pipeta apresenta uma faixa de volume ajustável, e é conhecida pelo volume máximo que pode dispensar. Por exemplo, a P1000 é capaz de dispensar volumes de 200 µL a 1000 µL (1 mL).

A lista abaixo relaciona as pipetas e os volumes que são capazes de dispensar com exatidão e precisão.

Princípio da técnica

A pipeta automática é um aparato composto de uma parte fixa, contendo todos os dispositivos para seu funcionamento, à qual se adapta uma ponteira removível (tip), normalmente de plástico. A parte fixa apresenta um pistão de aço inoxidável capaz de mover-se dentro de um cilindro. O movimento apropriado cria vácuo, fazendo com que o líquido em contato com a ponteira seja aspirado para dentro do cilindro, ocupando o volume antes ocupado pelo ar.

A alta exatidão indica que as pipetas automáticas dispensam volumes bastante aproximados do volume indicado no equipamento. A precisão está relacionada à reprodutibilidade de mensurações individuais de um mesmo volume, e também pode ser expressa como um desvio padrão.

A tabela abaixo mostra alguns exemplos de exatidão e precisão de pipetas.

Aparato experimental

O aparato experimental para o uso da pipeta automática consiste dos seguintes componentes:

Pipeta monocanal

Pipeta multicanal

Canaleta (para a pipeta multicanal)

Estantes (racks) com as ponteiras adequadas para cada pipeta automática

Frasco de descarte de ponteiras

Auto-play - ligado

Procedimento

Para a obtenção de resultados corretos é necessário selecionar a pipeta certa. O volume a ser transferido deve estar dentro da faixa de volume recomendada para a pipeta. Por exemplo, para transferir 2,48 µL, a pipeta mais adequada é a P-10, já que este volume está dentro da faixa de precisão para esta pipeta. Uma P-2 não seria adequada, pois o volume ultrapassa o máximo para a pipeta (2,00 µL). Uma P-20 (volumes entre 2 - 20 µL) também não seria adequada devido ao volume estar muito próximo do mínimo permitido pela pipeta. O uso de pipetas automáticas fora de suas respectivas faixas de precisão resulta em erros nos volumes medidos e na perda de regulagem da pipeta.

Selecionada a pipeta adequada, é necessário ajustar o volume de interesse. Para isso, pegue a pipeta com uma das mãos e gire o botão de ajuste com a outra mão até chegar ao volume desejado. Existe um anel no meio do botão que bloqueia o volume. Para o ajuste fino do volume é necessário girar o botão 1/3 acima do volume desejado e voltar lentamente para a configuração exata. Isso aumenta a precisão da medida.

O visor digital indicador de volume geralmente tem três dígitos e é lido na direção do botão de pipetagem para a base (onde se encaixa a ponteira). Os três dígitos indicam o volume em microlitros e podem ser coloridos em preto ou vermelho. Se houver esta distinção de cores, os dígitos pretos indicam volumes inteiros e os vermelhos, indicam frações. Os algarismos significativos variam de pipeta para pipeta e são, via de regra, 0,05% do volume máximo da pipeta. Por exemplo, a P-20 chega a 0,01µL e a P-200 a 0,1 µL.

Depois de ajustado o volume, coloque a ponteira na pipeta de forma que fique bem presa. Aperte o botão de pipetagem até sentir o primeiro ponto de resistência. Leve a pipeta com o botão apertado até o recipiente contendo o líquido a ser transferido. Com a pipeta na posição vertical, faça a ponteira imergir de 1 a 6 mm abaixo da superfície do líquido (1 mm para P-2; 4 mm para P-1000 e 6 mm para P-5000). Para fazer o líquido subir na ponteira, volte lentamente o botão para a posição inicial. Espere alguns segundo até que o líquido ocupe todo o volume. Retire a ponteira do líquido. Se ficarem algumas gotas do lado de fora da ponteira, passe cuidadosamente um papel no entorno sem encostar na abertura da ponteira.

Para dispensar o líquido, aperte novamente o botão até sentir a primeira resistência. Espere alguns segundo e depois aperte até sentir a segunda resistência. Isso permite dispensar o restante do líquido.

Para retirar a pipeta do recipiente, mantenha o botão apertado no segundo ajuste e deslize cuidadosamente a ponta da ponteira pela parede do recipiente. Volte o botão para a posição inicial lentamente. Para descartar a ponteira, aperte o botão ao lado do botão de pipetagem.

A manipulação de líquidos viscosos utilizando pipetas automáticas pode ser difícil, uma vez que a viscosidade limita a velocidade com que o liquido é aspirado. Para estas aplicações, são recomendadas pipetas específicas para líquidos viscosos.

 

Auto-play - ligado

Cuidados técnicos

Não exceda o volume máximo recomendado de cada pipeta, pois o mecanismo de ajuste de volume pode ser danificado. Também não utilize menos do que o mínimo recomendado, pois isso diminui a exatidão das medidas.

O braço contendo o mecanismo ejetor de ponteiras pode ser retirado caso o frasco de onde se pretende retirar o líquido seja muito estreito.

Geralmente as pipetas são calibradas utilizando água. Para líquidos com densidades muito diferentes da água, os volumes transferidos são incorretos. Para contornar este problema é possível ajustar o volume para mais (densidades muito maiores) ou para menos (densidades muito menores). No entanto, este ajuste deve ser determinado empiricamente, utilizando-se valores de densidade e massa (lembre que volume = massa/densidade).

Nunca coloque a pipeta na posição horizontal se a ponteira estiver cheia de líquido. Isso pode causar a entrada de líquido no sistema de pistões, o que irá danificar a pipeta.

Caso soluções corrosivas sejam transferidas é recomendado que, após o uso, a pipeta seja desmontada para avaliação das peças e para limpeza, se necessário. O desmonte e descontaminação também são recomendados após o uso com substâncias tóxicas e/ou carcinogênicas.

Evite a formação de bolhas quando aspirar o líquido. Isso reduz a precisão das medidas. Caso ocorra a formação de bolhas, dispense o líquido no frasco original, e faça subir o líquido novamente de forma lenta. Caso volte a formar bolhas, dispense o líquido no frasco original e troque a ponteira. O uso de ponteiras siliconizadas também pode evitar a formação de bolhas em casos em que estas sejam recorrentes, como na pipetagem de soluções de ácidos nucleicos.

Cuidados com a segurança

Use o EPI: óculos de segurança, avental, luvas e calçados fechados.